熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是 20 世紀 80 年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術。那么你知道熒光原位雜交（FISH）的實驗步驟是什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、實驗材料準備

1. 實驗用具及材料

（1）人的 MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本；

（2）指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫 20 等；

（3）恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400 熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。

二、實驗方法及步驟

1. 探針變性

將探針在 75℃恒溫水浴中溫育 5 min，立即置 0℃，5～10 min，使雙鏈 DNA 探針變性。

2. 標本變性

（1）將制備好的染色體玻片標本于 50℃培養(yǎng)箱中烤片 2～3 h。（經(jīng) Giemsa 染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片標本，將其浸在 70～75℃的體積分數(shù) 70% 甲酰胺/2×SSC 的變性液中變性2～3 min。

（3）立即按順序?qū)吮窘?jīng)體積分數(shù) 70%、體積分數(shù) 90%和體積分數(shù) 100%冰乙醇系列脫水，每次 5 min，然后空氣干燥。

3. 雜交

將已變性或預退火的 DNA 探針 10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上 18×18 蓋玻片，用 Parafilm 封片，置于潮濕暗盒中 37℃雜交過夜（約 15～17 h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。

4. 洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

（1） 雜交次日，將標本從 37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2） 將已雜交的玻片標本放置于已預熱 42～50℃的體積分數(shù) 50%甲酰胺/2×SSC 中洗滌3 次，每次 5 min。

（3） 在已預熱 42～50℃的 1×SSC 中洗滌 3 次，每次 5 min。

（4） 在室溫下，將玻片標本于 2×SSC 中輕洗一下。

（5） 取出玻片，自然干燥。

（6） 取 200 μL 復染溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

5. 雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針）

（1） 在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育 20min。

（2） 去掉保鮮膜，再加 150 μL avidin-FITC 于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育 40 min。

（3） 取出標本，將其放入已預熱 42～50℃的洗脫液中洗滌 3 次，每次 5 min。

（4） 在玻片標本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育 20 min。

（5） 去掉保鮮膜，加 150 μL antiavidin 于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育 40 min。

（6） 取出標本，將其放入已預熱 42～50℃的新洗脫液中，洗滌 3 次，每次 5 min。

（7） 重復步驟（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室溫清洗一下。

（8） 取出玻片，自然干燥。

（9） 取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

6. 封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有 Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數(shù)月之久。

7. 熒光顯微鏡觀察 FISH 結(jié)果

先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，FITC 的激發(fā)波長為490 nm。細胞被 PI 染成紅色，而經(jīng) FITC 標記的探針所在的位置發(fā)出綠色熒光。

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